Laboratorio de Microscopia Avanzada de Valparaíso
Eduardo Couve Montané
El Laboratorio de Microscopia Avanzada – Eduardo Couve Montané se ha consolidado como uno de los laboratorios de microscopía más completo y modernos del país. Concebido con el objetivo de apoyar la docencia e investigación científica de vanguardia, pone a disposición de la comunidad científica y académica local equipos y técnicas más avanzadas que existen en microscopía para el estudio de diferentes procesos y muestras biológicas.
MODELO: Nikon C1 Plus
El Microscopio Confocal permite el estudio de muestras con marcaje fluorescente, obteniéndose secciones ópticas de las mismas mediante la excitación de la muestra punto a punto por medio de un barrido láser, permitiéndose el análisis de muestras de un grosor de 100 y 200 µm dependiendo de espécimen, las cuales pueden estar marcadas con fluorescencia sin seccionamiento. Las secciones ópticas se generan eliminando la fluorescencia desenfocada y se muestran como imágenes digitalizadas. Permite la reconstrucción tridimensional y el estudio de muestras in vivo a lo largo de una secuencia temporal o para la colocalización de distintos marcadores en una región concreta.
MODELO: Nikon C1 Plus
El Microscopio Confocal permite el estudio de muestras con marcaje fluorescente, obteniéndose secciones ópticas de las mismas mediante la excitación de la muestra punto a punto por medio de un barrido láser, permitiéndose el análisis de muestras de un grosor de 100 y 200 µm dependiendo de espécimen, las cuales pueden estar marcadas con fluorescencia sin seccionamiento. Las secciones ópticas se generan eliminando la fluorescencia desenfocada y se muestran como imágenes digitalizadas. Permite la reconstrucción tridimensional y el estudio de muestras in vivo a lo largo de una secuencia temporal o para la colocalización de distintos marcadores en una región concreta.
Especificaciones
- Microscopio derecho
- Objetivos 4x, 10x, 20x, 40x, 100x
- Cámara de colores
- Imágenes de alta calidad con una resolución de hasta 2048 x 2048 píxeles y escala de grises de 12 bits.
- Cuenta con una fuente de excitación de 3 láser, 408, 488 y 543 nm y tres fotomultiplicadores para detección simultánea de tres canales de fluorescencia, además de un canal adicional de transmisión con contraste diferencial (Nomarski).
Aplicaciones
La amplia gama de aplicaciones disponibles para la microscopía confocal láser incluye una amplia variedad de estudios en ciencia de materiales, así como estudios morfológicos de un amplio espectro de células y tejidos.
- Detección de marcajes immunocitoquímicos
- Hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH).
- Análisis fisiológico de respuesta de Ca2+.
- Estudio de interacciones entre proteínas mediante la técnica FRET
- Estudio de transporte de proteínas mediante la técnica FRAP
- Análisis de células in vivo y en tiempo real mediante marcadores y/o proteínas de fusión fluorescentes.
- Desarrollo de metodologías para el análisis in vivo de células, estudios fisiológicos y análisis de interacción entre proteínas.
Descripción
El sistema confocal Nikon C1 proporciona imágenes fluorescentes confocales tridimensionales de muestras con alta resolución y contraste.
La imagen confocal fluorescente es importante en la captura de imagen de células vivas. Se pueden obtener imágenes de eventos dinámicos en las células (time-lapse) y se pueden ver en 3D. Permite, dentro de otras cosas, el estudio en detalle de la morfología y funcionamiento celular, de la dinámica de movimiento de proteínas y organelos, que no es posible lograr con la microscopia convencional.
En la imagen obtenida por el laboratorio del doctor Oliver Schmachtenberg, por ejemplo, se puede observar en color verde una neurona de la retina que, por su extremo superior, recibe la información de los fotoreceptores (la imagen que viene del exterior), y por su extremo inferior a través, de otras capas de la retina (en rojo), se conecta al nervio óptico para enviar la información a nuestro cerebro.
Bárbara Cádiz
MODELO: Scientifica Multiphoton Galvo System MP-1000
La microscopía de excitación de dos fotones es una técnica que permite obtener imágenes de fluorescencia en tejido grueso vivo. A diferencia de la microscopía confocal, esta técnica utiliza fotones de casi el doble de longitud de onda, permitiendo una mayor capacidad de penetración en la muestra. A su vez, son fotones de la mitad de energía, por lo que se requieren de dos fotones (de ahí su nombre) cuya energía se adiciona para llevar los electrones de la molécula fluorescente a un estado de transición energética mayor. Estos fotones deben coincidir de forma rápida y focalizada en la muestra, por lo que requiere de un láser ultra rápido que genera pulsos en el orden de los femtosegundos. Las propiedades de esta técnica permiten trabajar en muestras vivas de mayor espesor, disminuyendo la fototoxicidad (daño del tejido) y el fotoblanqueamiento.
Especificaciones
- Láser Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire de longitud de onda de excitación ajustable (690 – 1040 nm). Diámetro del haz <1,2 mm. Intensidad promedio a 800 nm >2,5 W.
- Espejos de escaneo Galvo. Velocidad máxima de escaneo en frames: 4 fps a una resolución de 512×512 px. Velocidad máxima de escaneo lineal: 1kHz.
- Fotomultiplicadores para fluorescencia reflejada y transmitida en canales rojo y verde.
- Sistema de iluminacion LED CoolLED pE-300ultra que puede ser activado por pulso TTL para experimentos que requieran estimulación optogenética.
- Objetivos de inmersión en agua 16x y 60x.
- Sistema para electrofisiología: amplificador Multiclamp 700B, convertidor análogo-digital Digidata 1550B, software de adquisición de datos Clampex, software de análisis Clampfit.
Aplicaciones
Algunos de los fenómenos que se pueden identificar con esta tecnología incluyen:
- Imágenes de calcio en espinas dendríticas al mismo tiempo que se registra la actividad eléctrica de la neurona.
- Visualización de la morfología celular y de la plasticidad sináptica estructural.
- Visualización y seguimiento del movimiento de proteínas intracelulares.
- Experimentos in vivo en organismos pequeños, tales como el nemátodo Caenorhabditis elegans.
Descripción
La microscopía de excitación de dos fotones (2PE) permite una microscopía de fluorescencia de alta resolución y alta sensibilidad en tejido neural intacto. En los últimos 10 años, las aplicaciones de 2PE, incluidas la microscopía y la fotoestimulación, han contribuido a la comprensión de una amplia gama de fenómenos neurobiológicos, ya que posibilita observar la actividad neuronal en el animal vivo y conocer los cambios ultraestructurales y celuares en condiciones normales como patológicas.
En la imagen A, se observa una neurona piramidal de corteza prefrontal medial, la cual fue llenada con un colorante fluorescente rojo. La imagen de esta neurona fue adquirida desde una rebanada viva de cerebro de ratón. En B se pueden ver tres espinas alojadas en la misma dendrita. En C podemos ver un ejemplo de escaneo lineal de la zona marcada en B. Esta imagen fue adquirida por Camila Morales utilizando objetivo de inmersión 60x.
MODELO: JEOL JEM1400-Plus
El microscopio electrónico de transmisión (MET) es una técnica microscópica donde un haz de electrones acelerados es conducido en una cámara al vacío a través de una muestra ultra-fina convenientemente preparada, mediante lentes electromagnéticos, interactuando con la muestra a medida que pasa por ella. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan. Todos los electrones son conducidos y modulados por unas lentes para formar una imagen final sobre un dispositivo de carga acoplada formando una imagen aumentada de la muestra. La información que se obtiene es una imagen con distintas intensidades de gris que se corresponden al grado de dispersión de los electrones incidentes.
Especificaciones
- Resolución 0.2 nm (HC) 0.14 nm （HR）
- Tensión de aceleración de 10 a 120 kV
- Aumento 150 a 1.000.000 x
- Camera digital Gatan de 4 MP
Aplicaciones
Se utiliza en la observación de especímenes biológicos que incluyen materiales macro-moleculares, medicamentos, secciones patológicas y virus. Por lo general, la vista completa de los tejidos, las estructuras, las ubicaciones objetivo y el área de observación se confirman primero con un bajo aumento, y luego se estudian cuidadosamente las estructuras finas de interés en gran aumento.
Descripción
La microscopía electrónica de transmisión es una herramienta de estudio fundamental en biología, puesto que permite la visualización y el análisis de la ultraestructura tisular y celular, a niveles de resolución nanométrica. La alta capacidad resolutiva de la microscopía electrónica de transmisión es imprescindible para el avance de las ciencias biomédicas, porqué cambios fisiológicos o patológicos en los organismos siempre se basan en alteraciones al nivel sub-celular y molecular.
Técnicas de inmunomarcación con partículas de oro, con o sin amplificación por plata, permiten identificar y localizar componentes celulares a niveles insospechados, y no tienen límites de aplicación. A modo de ejemplo, se logró la detección de los neurotransmisores GABA y glutamato en anémonas marinas mediante esta metodología (Delgado et al., 2010 J Morphology).
La microscopía electrónica de transmisión es fundamental también en áreas de diagnóstico, patología, virología y estudios de colonias bacterianas. Por ejemplo, utilizando microscopía electrónica de transmisión hemos identificado y caracterizado el sistema autofágico-lisosomal en odontoblastos humanos, estableciendo correlatos que permiten comprender el recambio de organelos y estrategias de sobrevivencia celular mediante autofagia y aislamiento de desechos celulares (Fig. 1A).
En una reciente investigación integrantes del laboratorio del doctor Oliver Schmachtenberg han analizado la ultraestructura de los segmentos internos de los fotorreceptores en búsqueda de alteraciones morfológicas de las mitocondrias (Fig. 2 A y B).
Este tipo de microscopía también permite estudiar tejidos (Fig. 3A), organelos intracelulares (Fig. 3B) o células especializadas (Fig. 3C), entre otras aplicaciones en ciencias de materiales.
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Microscopía LASER-TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)
La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM por sus siglas en inglés) es una técnica especial de la microscopia de fluorescencia que permite excitar selectivamente fluoróforos como por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP), tintes de membrana, fluorocromos unidos a anticuerpos, entre otros; en regiones restringidas de una muestra que son inmediatamente adyacentes a la interfaz entre el portaobjetos (cristal) y la solución que la contiene. Esto ocurre cuando la luz incidente es reflejada internamente en su totalidad en la interfaz de cristal y agua, generándose las llamadas ondas evanescentes, que forman un campo electromagnético que incide en los fluoroforos y que disminuye exponencialmente desde la interfaz, y por tanto penetra a una profundidad de hasta 100 nm desde la superficie del vidrio. Esto permite una visualización selectiva de regiones de la superficie de células como la membrana y eventos que ocurren sobre esta, en células vivas, observándose con una alta resolución axial resultando ser una herramienta importante de la biofísica y la biología cuantitativa.
Especificaciones
- Microscopio invertido motorizado (Eclipse Ti-E, Nikon)
- Objetivo (CFI Apochromat TIRF 60X/1.49 NA y 100X/1.49 NA, Nikon)
- LASER (488-20LS, OBIS, Coherent)
- LASER (Unidad LASER DPSS (Coherent compass, 561nm 20mW))
- Cámara C11440 (ORCA-FLASH 2.0; Hamamatsu Photonics)
- Sofware (NIS-Element viewer 4.3, Nikon)
Aplicaciones
La microscopia TIRF es una excelente técnica para combinar estudios cinéticos con información espacial en muestras vivas o in vitro. Se aplica de forma rutinaria para investigar fenómenos asociados a las membranas como:
- Adhesión de células en distintas superficies
- Unión de hormonas
- Transporte de proteínas de membrana (por ejemplo canales o receptores) a la mambrana plasmática.
- Procesos de exocitosis o endocitosis (por ejemplo: liberación y captura de neurotransmisores)
Descripción
Ejemplo de uso en CINV: Mediante el uso de campo evanescente restringido espacialmente para excitar fluoróforos, la microscopia TIRF permite la observación de la ubicación y dinámica de moléculas y procesos en una sección óptica muy cerca o dentro de la membrana plasmática. En el Laboratorio del Dr. Agustín Martínez se ha utilizado esta técnica para estudiar el tráfico de conexinas silvestres y mutantes hacia la membrana celular (ej: Cx43EGFP, Cx26GFP).
Las conexinas constituyen una familia de proteínas que forman canales de unión de hendidura (UH). Estos conectan el citoplasma de células adyacentes mediante el acoplamiento, cabeza a cabeza de dos hemicanales (HC) que son arreglos hexaméricos de monómeros de conexina.
Mutaciones en la conexina 26 (Cx26), han sido asociadas con sordera hereditaria. Se ha sugerido que estas mutaciones pueden alterar las propiedades de los canales de UH que forman, incluyendo permeabilidad, selectividad y mecanismos de apertura y cierre.
En la figura se puede observar la direccionalidad preferencial del tráfico de HCs de Cx43 hacia Hot-spots en la membrana de aposición celular regulado por citoesqueleto de actina. El modelo experimental consiste en el análisis de TIRF combinado con un tipo especial de microscopia contraste de fase (SIRC; surface interference reflection constrast) para determinar la posición de la membrana plasmática (zonas oscuras).
L-RET (Lanthanide-based resonance energy transfer) es una técnica espectroscópica, variante de la técnica de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET), muy sensible, basada en la transferencia de energía de un donante a un aceptor, que depende de la distancia que separa estas sondas espectroscópicas, por lo que esta técnica es muy útil para el estudio de cambios conformacionales en proteínas dentro del rango de distancia de 10-100 Å. L-RET utiliza lantánidos luminiscentes, con mayor frecuencia terbio quelado (Tb3+) como donante en lugar de fluoróforos convencionales, lo que ofrece ventajas como una vida útil más
prolongada de las emisiones solo del donante, la flexibilidad para usar fluoróforos aceptores múltiples y la oportunidad de detectar la emisión de aceptores sensibilizados de una manera sencilla para medir la transferencia de energía sin el riesgo de detectar también la señal del donante.
Especificaciones
- Láser Quanta-Ray Lab-Series (Spectra Physics)
- El rayo de excitación láser pasa a través de una óptica de excitación compuesta por un prisma Pellin-Broca de sílice fundida (Thorlabs) y filtro de limpieza UG11, seguido de un láser dicroico personalizado de 266 nm sin recubrimiento antirreflectante (AR) (Z266rdc; Chroma Technology)
- Objetivo de inmersión 40x (1,25 N.A.) sin revestimiento AR (Partec GmbH)
- Filtros de emisión E515LPv2 de paso largo o D520/20m de paso de banda (Chroma Technology) para emisiones de OD o grabaciones SE, respectivamente.
- Tubo fotomultiplicador con compuerta (Hamamatsu)
- Filtro Bessel de ocho polos
Aplicaciones
Esta técnica se ha utilizado con éxito para:
- Medir distancias intramoleculares como por ejemplo aminoácidos entre proteínas lo que permite determinar forma espacial de estas.
- Rastrear cambios estructurales en proteínas como por ejemplo en los canales de K+ y Na+ dependientes del voltaje evaluando su funcionalidad.
- Estudios de interacciones proteína-proteína en células
- Ensayos para medir la dimerización de péptidos asociado con factores de transcripción e interacciones ligando-receptor.
Descripción
Usando L-RET, se ha buscado, por ejemplo, medir distancias intramoleculares en el canal de K+ activado por Ca2+ (BK), uno de los canales más ampliamente expresados en los mamíferos; en ausencia y presencia de proteínas integrales de membrana, denominadas subunidades β, y determinar los cambios conformacionales inducidos por depolarización.
En el laboratorio del Dr Ramón Latorre utilizaron una etiqueta de unión a lantánidos (LBT) codificada genéticamente para unir terbio como donante L-RET y una iberiotoxina marcada con fluoróforo como aceptor L-RET para las mediciones de distancias dentro de la estructura del canal BK en una célula viva con la estrategia presentada en la figura. (Carrasquel-Ursulaez et al., Biophysical Journal (2018))
